Après des études d’histoire de l’art à l’École du Louvre, Sébastien Lifshitz travaille dès 1990 dans le milieu de l’art contemporain. Il se tourne ensuite vers le cinéma et réalise de plusieurs court-métrages, notamment Il faut que je l’aime (1994), Les Corps Ouverts (1998, prix Jean Vigo et prix Kodak du meilleur court-métrage) et le téléfilm Les Terres Froides (1999) pour ARTE, sélectionné à la Mostra de Venise. En 2000, il réalise son premier long-métrage, Presque Rien, puis en 2001, La Traversée, road-movie documentaire sélectionné à Cannes, à la Quinzaine des Réalisateurs. En 2008, il entreprend le tournage de Plein Sud, qui sera présenté à la Berlinale en 2010. Puis, en 2012, il réalise le documentaire Les Invisibles, présenté en sélection officielle (hors compétition) au festival de Cannes. Le film obtiendra le César du meilleur film documentaire en 2013. La même année, Sébastien Lifshitz termine le film documentaire Bambi qui est présenté à la Berlinale où il remporte le Teddy Award. En 2016, le documentaire Les Vies de Thérèse est sélectionné au Festival de Cannes et à la Quinzaine des Réalisateurs où il remporte la Queer Palm. 

La même année, Sébastien Lifshitz est le commissaire de l’exposition Mauvais Genre, Les travestis à travers un siècle de photographies amateurs issue de sa grande collection de photographies vernaculaires. L’exposition sera montrée aux Rencontres d’Arles, à la Galerie du Jour Agnès b.à Paris et à la Photographers’ Gallery de Londres, puis au Musée des Beaux-Arts de Montréal en 2020. À l’automne 2019, à l’occasion de la sortie de son nouveau film Adolescentes et de l’ouvrage L’Inventaire infini, le Centre Pompidou organise une exposition rétrospective mêlant ses films et ses photographies.